Большинство патогенных микроорганизмов выращивают

Выращивание микроорганизмов

Казахстанско-Российский медицинский университет

Кафедра Микробиологии с основами иммунологии

СРС

На тему: ПРИНЦИПЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ

Выполнила: Ильясова А.М.

Факультет: стоматологический гр. 206

Алматы 2014.

ПРИНЦИПЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ

Микроорганизмы (за исключением облигатных внутриклеточ­ных паразитов — риккетсий, хламидий, вирусов и простейших) культивируют, как правило, на искусственных питательных средах. В зависимости от пищевых потребностей того или другого вида питательные среды должны содержать соответствующие исходные вещества, необходимые для пластического и энергетического метаболизма.

Выделение микроорганизмов из различных материалов и по­лучение их культур широко используется в лабораторной практике для микробиологической диагностики инфекционных за­болеваний, в научно-исследовательской работе и в микробиоло­гическом производстве вакцин, антибиотиков и других биоло­гически активных продуктов микробной жизнедеятельности.

Условия культивирования также зависят от свойств соответ­ствующих микроорганизмов. Большинство патогенных микробов выращивают на питательных средах при температуре 37 °С в те­чение 1—2 сут. Однако некоторые из них нуждаются в более длительных сроках. Например, бактерии коклюша — в 2—3 сут, а микобактерии туберкулеза — в 3—4 нед.

Для стимуляции процессов роста и размножения аэробных микробов, а также сокращения сроков их выращивания ис­пользуют метод глубинного культивирования, который заключа­ется в непрерывном аэрировании и перемешивании питательной среды. Глубинный метод нашел широкое применение в биотех­нологии.

Для культивирования анаэробов применяют особые методы, сущность которых заключается в удалении воздуха или замены его инертными газами, в герметизированных термостатах — анаэростатах. Анаэробов выращивают на питательных средах, содержащих редуцирующие вещества (глюкозу, муравьинокис-лый натрий и др.). уменьшающиеокислительно-восстановитель­ный потенциал.

Выращивание микроорганизмов

Питательные среды должны бытьтакими, что легко усваиваются, с определенным составом азотистых веществ, углеводов, витаминов и соответствующей концентрацией солей, изотоническими, стерильными, иметь буферные свойства, оптимальную вязкость и определен окислительно восстановительный потенциал.

Микроорганизмы, которые нуждаются в высоких концентрациях солей, называют галофильними.Они распространены в морях, океанах, соленых озерах. К ним принадлежат некоторые патогенные для человека виды (Vibrioparahaemolyticus и др.).

В течение всей истории микробиологии питательные среды постепенно совершенствовались. В допастеровский период как среды для выращивания микроорганизмов применяли только настои и отвары. Л. Пастер и К. Негели внедрили в практику культивирования безбелковые среды.

Р. Кох и Ф. Леффлер для выращивания бактерий использовали мясную воду, пептон и натрия хлорид. Эта среда являет собой мясо-пептонный бульйон (МПБ), из которого готовят мясо-пептонныйагар (МПА), добавляя 1—2 % агара.

Агар — твердый волокнистый материал, который добывают из некоторых водорослей. В водных растворах он образует густой гель (студень). Агар состоит из 70—75 % полисахаридов, 2—3 % белков и других азотсодержащих веществ, 2—4 % золы. Основными компонентами агараявляются высокомолекулярные вещества — агароза и агаропептин. Агар растворяется в воде при нагревании и охлаждается при комнатной температуре. Его выпускают в виде бесцветных пластинок или порошка. Благодаря свойству агара предоставлять питательному субстрату при охлаждении консистенцию густого геля и высокой стойкости к ферментативному действию микроорганизмов его широко применяют при изготовлении полужидких, плотных и сухих питательных сред.

Разработана методика изготовления синтетического полимерного материала, который используется для приготовления густых питательных сред и с успехом заменяет естественный дефицитный агар.

Требования к питательным средам. Для выращивания бактерий в лабораторных условиях, исследования их разнообразных свойств, длительного хранения используют питательные среды. Они должны отвечать определенным стандартам, создавая оптимальные условия для роста, размножения и жизнедеятельности микроорганизмов.

В первую очередь, бактерии нуждаются в азоте, углероде и водороде для построения собственных белков. Водород и кислород для клеток поставляет вода. Источником азота выступают многочисленные вещества, в основном, животного происхождения (мясо говяжье, рыба, мясо-костная мука, казеин), а также белковые гидролизаты, пептиды, пептоны. Можно использовать и заменители мяса – плаценту, кровяные сгустки, дрожжи. Следовательно, в состав сред должны быть введены источники питательных веществ и вода, а также ростовые факторы (витамины группы В, ферменты). Универсальным источником их служат экстракты из белков животного и растительного происхождения, белковые гидролизаты. Для микробов с более сложными пищевыми потребностями в состав сред включают нативные субстраты – кровь, сыворотку, асцитическую жидкость, яичный желток, кусочки печенки, почек, мозговой ткани и др.

Читать также:  Как выращивать огурцов в теплице из поликарбоната

Среды должны быть сбалансированными за микроэлементным составом и содержать ионы железа, меди, марганца, цинка, кальция, натрия, калию, иметь в своем составе неорганические фосфаты.

Допускается применение веществ, которые устраняют действие ингибиторов роста и токсиноутвореннямикробов (отдельные аминокислоты, твіни, активирован уголь и тому подобное). Важной является стабилизация оптимума рН среды, его высокой буферності и уровень окислительно восстановительного потенциала (Еh), который для аеробних микроорганизмов достигает свыше 0,08 В, а для анеробних бактерий колеблется в пределах 0,12-0,60 В.

Среды должны иметь определенную вязкость, плотность, иметь определенную влажность (до 20 % воды), быть изотоническими, прозрачными и обязательно стерильными.

Oсновныетребования к питательнымсредам:

3. лёгкая усвояемость

4. определенный состав азотистых веществ, углеводов, витаминов,

6. определённая вязкость и окислительно-восстановительный баланс

Основные питательные среды. Многочисленные потребности микроорганизмов предопределяют большое разнообразие питательных сред, а для отдельных видов бактерий существуют специальные среды. Часть их готовят в лабораториях непосредственно перед посевом, но с каждым годом появляются все новые и новые среды заводского изготовления (сухие), которые способны удовлетворить самые прихотливые потребности микробиологов. Они сохраняются длительное время, имеют стандартный состав.

Среды разделяются на естественные и искусственные. Как естественные используют свернутую сыворотку, молоко, яйца, мышечную ткань. Искусственные среды создают путем комбинирования разнообразных субстратов, которые обеспечивают те или другие потребности микроорганизмов. Их используют в основном для экспериментального изучения отдельных звеньев метаболизма бактерий.

В зависимости от своей плотности, среды разделяются на жидкие, полужидкие и плотные. Полужидкие и плотные среды готовятся из жидких, добавляя соответственно 0,3-0,7 % но 1,5-2,0 % агара. Последний представляет собой волокнистый материал, который добывают из морских водорослей. Состоит он из полисахаридов (70-75 %), белков (2-3 %), основными составляющими частями является высокомолекулярные агароза и агаропептин. Агар растворяется в воде при повышенной температуре, а, застигая, предоставляет среде драглеподібної консистенции и стойкости к ферментным системам бактерий. Именно за эти свойства он приобрел широкое распространение в микробиологической практике. Для создания плотных сред используют также желатин (10-15 %), свернутую сыворотку крови.

Условия выращивания (культивирования) микроорганизмов

К важнейшим условиям выращивания микроорганизмов на питательных средах относятся температура, свет, аэрация среды.

4.4.1 Температура. Для оптимального развития микроорганизмов необходима температура, соответствующая видовым потребностям культуры. По отношению к температуре микроорганизмы подразделяются на холодолюбивые (психрофилы), среднетеплолюбивые (мезофилы) и теплолюбивые (термофилы).

Оптимальные температуры развития психрофилов составляет 6-10 о С, но некоторые могут развиваться и при температуре около 0 о С. Температурный оптимум для мезофилов составляет 25 — 30 о С, а термофилов 50-60 о С.

Большинство видов бактерий активно размножаются при температуре 30-37 о С, а мицеллиальные грибы – при 20-22 о С. При отклонении температуры от оптимальной развитие микроорганизмов задерживается. Поэтому для выращивания микроорганизмов используются специальные приборы – термошкафы с термоизоляцией, способные поддерживать постоянную температуру, соответствующую потребностям культур. Такие приборы называются термостатами.

4.4.2 Свет. Большинство микроорганизмов не нуждаются в свете, а прямые солнечные лучи подавляют их развитие. В связи с этим микроорганизмы выращивают в неосвещенных термостатах.

4.4.3 Аэрация. Потребности в свободном кислороде у микроорганизмов неодинаковы. Аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы выращивают в обычных условиях воздушной среды. Культивирование строгих анаэробов должно производиться в бескислородных условиях, которые создаются различными приемами.

Для культивирования анаэробов применяют:

а) специальные приборы – анаэростаты, из которых выкачивают воздух посредством насоса, а затем помещают в термостат;

б) эксикаторы, из которых воздух либо удаляется, либо заменяется инертным газом (азотом, водородом, диоксидом углерода);

в) аппарат Аристовского – герметически замкнутый сосуд, где происходит связывание кислорода воздуха с помощью химических соединений (щелочного раствора пирогаллола, металлического железа и т.д.);

г) выращивание микроорганизмов в жидкой среде – пробирке 10-15см 3 , залитой слоем стерильного индиффирентного (вазелинового) масла или парафина;

д) розливка среды в узкие пробирки высоким столбиком;

е) совместное выращивание анаэробов и аэробов, обильно поглощающих кислород в герметично залитой парафином чашке Петри.

Читать также:  Как выращивают помидоры в теплице в промышленных масштабах

4.4.4 Сроки культивирования. Большинство культур аэробных бактерий выращивают в течение 24-36ч, анаэробных – 36-72ч, плесневые грибы культивируют в течение недели.

4.4.5 Счет колоний. При небольшом количестве выросших колоний их считают методом прямого счета, с помощью лупы, отмечая сосчитанные колонии восковым карандашом. Для удобства чашки Петри можно разделить на равные сектора, подсчитать количество колоний в одном секторе и, перемножив это количество на число секторов, можно определить общее число колоний, выросших на чашке Петри. Если количество колоний велико и прямой счет их затруднителен, то можно применять специальные счетные камеры – аппарат Вольфюгеля, пластинки Лафара и др.

1) Подготовить пробирки, чашки Петри и пипетки к стерилизации.

2) Приготовить МПА из сухого питательного агара, разлить в пробирки, колбы и простерилизовать в автоклаве.

3) Приготовить агар-«столбик» и агар-«косячок» в пробирках.

4) Разлить МПА в чашки Петри.

5) Произвести посев «штрихом», «уколом» из пробирки в пробирку и посев «газоном» из пробирки в чашку Петри.

6) Оформить протокол исследования, схематически изобразив посев «штрихом», «уколом», «газоном», и представить способы стерилизации в виде следующей таблицы.

Лекция 3. Физиология микроорганизмов. Метаболизм бактерий.;

Физиология микроорганизмов. Метаболизм бактерий.

Физиология микроорганизмов включает:

· культивирование (условия, среды, характер и скорость роста);

· выделение биологически активных веществ, токсинов и других факторов патогенности;

· чувствительность к антибиотикам, бактериофагам, бактериоцинам;

· другие биологические свойства.

Метаболизм бактерий― совокупность физико-химических процессов (химических превращений и реакций), направленных на воспроизводство структур и обеспечение жизненных функций микробной клетки, таких как:

· рост и размножение;

· отложение резервного пищевого материала;

· транспорт питательных веществ в микробную клетку;

· выделение продуктов метаболизма (токсинов, ферментов, антибиотиков и других биологически активных веществ);

· адгезия на рецепторах клеток хозяина и проникновение в них;

· различных адаптивных реакций на изменение внешней среды.

Анаболизм— совокупность биохимических реакций, осуществляющих синтез компонентов клетки.

Катаболизм— совокупность реакций, обеспечивающих клетку энергией.

Схема изучения метаболизма – этапы:

1. Начальный (периферический) метаболизм – проникновение веществ в клетку извне и распад до промежуточных продуктов.

2. Амфиболизм (промежуточный метаболизм) – образование промежуточных продуктов метаболизма, общих для катаболических и анаболических путей.

3. Конечные, строго специализированные этапы конструктивного метаболизма (ведут к построению структур клетки) и энергетического метаболизма (образование АТФ).

Механизмы проникновения питательных веществ в клетку:

· Простая диффузия (для истинных растворов). Энергонезависимый процесс.

· Облегченная диффузия («паром по течению») – в направлении градиента концентрации с участием белков – переносчиков. Энергозависимый процесс.

· Активный транспорт – против концентрационного и электрохимического градиента с участием пермеаз (амино-, оксикислотных, ионных и др.). Процесс идет с затратой энергии АТФ, зависит от заряда веществ и их трансформации в процессе переноса.

Микроорганизмы по способности усваивать источники углерода делятся на две группы: автотрофы (лат. autos — сам, trophe — питание) синтезируют все углеродсодержащие компоненты клетки из СО2 как единственного источника углерода и гетеротрофы (лат. heteros — другой, «питающийся за счет других») используют разнообразные органические углеродсодержащие соединения.

В зависимости от источников энергии и микроорганизмы подразделяют на фототрофы (фотосинтезирующие), способные использовать солнечную энергию, и хемотрофы (хемосинтезирующие), получающие энергию за счет окислительно-восстановительных реакций.

В зависимости от используемых доноров электронов бактерии разделяют на литотрофы (используют неорганические доноры электронов) и органотрофы (используют органические соединения).

Прототрофы ― микроорганизмы, способные синтезировать все необходимые им органические соединения из глюкозы и солей аммония.

Ауксотрофы ― микроорганизмы, не способные синтезировать какие-либо органические соединения. Они получают эти соединения в готовом виде из окружающей среды или организма человека.

Ферменты (от греч. fermentum ― закваска ) ― высокоспецифические белковые катализаторы, присутствующие во всех живых клетках, без которых не возможны жизнь и размножение. Ферменты распознают соответствующие им метаболиты (субстраты), вступают с ними во взаимодействие и ускоряют химические реакции. Ферменты являются белками.

Читать также:  Какие южные деревья можно выращивать в средней полосе

Ферментный состав микроорганизма определяется геномом и является достаточно стабильным признаком. Определение ферментов широко применяется для биохимической идентификации бактерий.

Эндоферменты катализируют метаболизм проходящий внутри клетки.

Экзоферменты выделяются клеткой в окружающую среду.

Конститутивные ферменты постоянно синтезируются в определенных концентрациях.

Индуцибельные ферменты – это ферменты, концентрация которых увеличивается при поступлении соответствующего субстрата.

Ферменты агрессии:гиалуронидаза, фибринолизин, нейраминидаза, коллагеназа, лецитиназа (лецитовителлаза), коагулаза, уреаза, аминокислотные декарбоксилазы, дезоксирибонуклеаза.

Культивирование― получение культур микроорганизмов в условиях искусственной питательной среды.

· получение чистых культур патогенных микроорганизмов и их идентификация;

· накопление биомассы продуцентов БАВ (витаминов, гормонов, аминокислот, антибиотиков и др.);

· получение диагностических и профилактических препаратов (вакцин, диагностикумов);

· хранение эталонных музейных культур.

Культура– популяция микроорганизмов, выращенная на питательной среде.

Чистая культура – популяция одного вида микроорганизмов, выращенная из изолированной колонии на питательной среде.

Большинство патогенных микробов выращивают на питательных средах при температуре 37°С в течение 1-2 сут.

Классификация питательных сред

По консистенции:жидкие, полужидкие, плотные.

По происхождению:естественные (молоко, картофель), искусственные, полусинтетические, синтетические.

По составу:простые (МПА, МПБ, овощи, молоко), сложные (1% глюкозы, 10-20% сыворотки крови, 20-30% асцитической жидкости, 5-10% дефибринированной крови).

· универсальные — среды, на которых хорошо растут многие виды бактерий. К ним относятся мясо-пептонный бульон (МПБ) и мясо-пептонный агар (МПА);

· специальные ― среды, специально приготовленные для получения роста бактерий, которые не растут на универсальных средах;

· дифференциально-диагностические ― среды, позволяющие отличать одни виды бактерий от других по ферментативной активности;

· селективные — среды, содержащие вещества, используемые микроорганизмами определенных видов и препятствующие росту других микроорганизмов. Селективные среды позволяют направленно отбирать из исследуемого материала определенные виды бактерий;

· дифференциально-селективные — среды, сочетающие в себе свойства дифференциально-диагностических и селективных сред;

Размножение бактерий на жидких и плотных питательных средах.

Рост ― координированное воспроизведение всех компонентов бактериальной клетки и увеличение ее биомассы. Размножение ― воспроизводство и увеличение количества клеток, приводящее к образованию бактериальной популяции.

Бактерии характеризуются высокой скоростью размножения. Скорость размножения зависит от видовой принадлежности, состава питательной среды, рН, температуры, аэрации.

На плотных питательных средах бактерии образуют скопления клеток, называемые колониями. Колонии разных видов отличаются по размерам, форме, консистенции, окраске, характеру краев, характеру поверхности, прозрачности. Характер роста на жидких питательных средах: пленочный (образованием пленки на поверхности питательной среды), диффузное помутнение, придонный (образование осадка).

Влияние факторов внешней среды на микроорганизмы

По отношению к температуре большинство патогенных микроорганизмов являются:

Оптимальной температурой роста для термофилов является:

Большинство патогенных микробов выращивают при температуре:

К низким температурам особенно чувствительны:

-возбудители сибирской язвы

Устойчивые к действию высоких и низких температур:

+споры сибирской язвы

Химическое вещество используемое для дезинфекции:

К поверхностно-активным веществам относятся:

+жирные кислоты, мыла

Вещества обладающие олигодинамическим действием:

+растворы серебра, ртути

Химические вещества — окислители, нарушающие деятельность ферментов, вызывающие денатурацию белков:

-соли тяжелых металлов

Химические вещества, используемые для обеззараживания ран, кожи:

Перевязочный материал стерилизуют в:

Наиболее надежный, эффективный способ стерилизации:

Стерилизацию воздуха в операционных, больницах, боксах проводят:-

Для приготовления 1 л. 1% раствора хлорамина необходимо взять вещества:

+химические вещества, используемые для лечения человека обеззараживания ран

-вещества, применяемые для стерилизации

-вещества, содержащие детергенты

+полное освобождение объекта от микроорганизмов

-система мероприятий, препятствующих микробному загрязнению объекта

-полное освобождение объекта от болезнетворных микроорганизмов

-комплекс мероприятий, направленных на уничтожение патогенныз и условно-патогенных микроорганизмов

В автоклаве стерилизуют:

-жидкости, содержащие белок

-одноразовые медицинские инструменты

Красители оказывают на микроорганизмы действие:

-снижают поверхностное натяжение

-вызывают повышение давления внутри клетки

+задерживают рост и размножение микроорганизмов

На жизнедеятельность бактерий не оказывает действия:

Действие альдегидов на бактериальную клетку:

-задерживают рост и размножение микроорганизмов

+приводят к денатурации белка

-вызывают окисление белка

-снижают поверхностное натяжение

studopedia.org — Студопедия.Орг — 2014-2019 год. Студопедия не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования (0.003 с) .

Источники:

http://mylektsii.ru/4-35715.html

http://lektsii.org/10-49180.html

http://studopedia.su/9_22426_lektsiya-.html

http://studopedia.org/13-120223.html

Ссылка на основную публикацию
Adblock
detector